應桂馨出身富家，父親在上海經營營造業，應桂馨早年曾中秀才，並擔任英文教師，後加入青幫，協助革命黨人在上海活動，並曾加入同盟會，與陳其美關係密切。辛亥革命時，陳其美組織滬軍都督府，應桂馨亦擔任諜報科長，孫中山回國後，應桂馨曾出任衛隊司令、南京總統府庶務科長等職，但因涉入不法而被孫中山撤職，回到上海，後又擔任巡查長。
1913年3月，宋教仁在上海遇刺，應桂馨被查出涉有重嫌，隨即被捕。二次革命期間，應桂馨趁亂逃獄，隱居於青島，又前往北京向袁世凱勒索，事敗後逃往天津。1914年1月19日，應桂馨在火車上遭京畿軍政執法處的特務暗殺。