杜聰明出生於淡水,早年在新莊車埕書房學習,後進入滬尾公學校就讀,在1909年以優異成績畢業。同年,杜聰明考入臺灣總督府醫學校,雖然體位不符但仍以其成績破例入學。1913年,杜聰明曾與同學翁俊明(臺籍同盟會會員)潛赴北京,計畫投毒暗殺袁世凱,但因警備嚴密而失敗,只得返臺。杜聰明在1914年畢業,次年獲得推薦赴日本京都帝國大學醫學院深造,於1922年獲得醫學博士學位,為首位臺灣出身的博士。
杜聰明返臺後於臺北帝國大學醫學部任教,主授藥理學,也是當時臺北帝大中唯一一位臺灣籍教授。戰後,由於醫學人才缺乏,杜聰明出任臺灣大學醫學院院長,後兼任臺灣省政府委員,1948年時曾代理臺大校長。1953年,杜聰明因與校方意見不合而辭職,另行創辦高雄醫學院,自任院長,直到1966年退休。1986年2月25日,杜聰明在臺北逝世。留有《藥理學教學論文集》、《回憶錄》等。